Entwicklung einer orthogonalen Markierungsmethode für die Fluoreszenzdetektion epigenetischer DNA-Modifikationen

  • Development of an orthogonal labeling method for fluorescence detection of epigenetic DNA modifications

Käver, Larissa; Weinhold, Elmar (Thesis advisor); Albrecht, Markus (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

5-Methylcytosin (5mC) und das Oxidationsprodukt 5-Hydroxymethylcytosin (5hmC) sind epigenetische Modifikationen, die an der Genregulation beteiligt sind und deren globale Veränderungen bei verschiedenen Arten von Krebs festgestellt wurden. [1-4] Die parallele Analyse des Gehaltes von 5mC und 5hmC kann potenziell als Biomarker für die Früherkennung, die Überwachung des Krankheitsverlaufs und das Ansprechen auf eine Behandlung dienen. Derzeitige Techniken zur globalen Quantifizierung von 5mC und 5hmC eignen sich noch nicht für klinische Anwendungen, da dafür beide Modifikationen sehr schnell im untersuchten Gewebe parallel mit unterschiedlichen Fluorophoren quantifiziert werden müssten. Ziel dieser Arbeit war daher die Entwicklung einer orthogonalen Methode zur parallelen globalen Fluoreszenzmarkierung der epigenetischen Modifikationen 5mC und 5hmC. Dazu lag ein Fokus dieser Arbeit zunächst auf der Synthese von Analoga des natürlichen Cofaktors AdoMet (1), die verschiedene Vinylmodifikation aufwiesen und in two-step labelling- Reaktionen Anwendung finden sollten. Weiterhin wurde die enzymatische Aktivität der neuen Cofaktoranaloga in Aktivitätstests mit verschiedenen Adenin- und Cytosin-spezifischen DNA-MTasen untersucht. Darauf aufbauend folgte zunächst die Untersuchung der zweistufigen DNA-Markierung zur Methylierungsdetektion mit den verschiedenen vinylischen Cofaktoranaloga und verschiedenen Tetrazinkonjugaten zur Fluoreszenzanalyse mit hoher und niedriger Markierungsdichte. Die Analyse der fluoreszenzmarkierten DNA erfolgte dabei an immobilisierten und gestreckten DNA-Einzelmolekülen (DNA-Combing) am institutseigenen Fluoreszenzmikroskop. Weiterhin wurde die Methylierungsdetektion zusätzlich durch eine einstufige Markierungsreaktion durch sequenzspezifische Modifikation von verschiedenen DNA-Substraten mit fluoreszierenden Cofaktoranaloga untersucht. Aufgrund der bedeutenden Rolle der epigenetischen Modifikationen 5mC und 5hmC in der Früherkennung von Krebs, wurde ebenfalls eine genomische Human-DNA-Probe (Brustkrebszelllinie, UK Aachen) markiert und von unseren Kooperationspartnern an der Tel Aviv University in Israel hinsichtlich der epigenetischen Information untersucht. Außerdem wurde neben der Methylierung auch die Hydroxymethylierung in einer zweistufigen Markierungsreaktion, sowie die orthogonale Bestimmung von 5mC und 5hmC fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Beide Einzeldetektionen sowie die orthogonale Bestimmung wurden zusätzlich hinsichtlich Reaktionsausbeuten auf kurzen Duplex-ODN mittels rp-HPLC quantifiziert. [1] P. A. Jones, S. B. Baylin, Cell 2007, 128, 683.[2] M. C. Haffner, A. Chaux, A. K. Meeker, D. M. Esopi, J. Gerber, L. G. Pellakuru, A. Toubaji, P. Argani, C. Iacobuzio-Donahue, W. G. Nelson, G. J. Netto, A. M. de Marzo, S. Yegnasubramanian, Oncotarget 2011, 2, 627.[3] M. Ko, Y. Huang, A. M. Jankowska, U. J. Pape, M. Tahiliani, H. S. Bandukwala, J. An, E. D. Lamperti, K. P. Koh, R. Ganetzky, X. S. Liu, L. Aravind, S. Agarwal, J. P. Maciejewski, A. Rao, Nature 2010, 468, 839.[4] A. P. Feinberg, R. Ohlsson, S. Henikoff, Nat. Rev. Genet. 2006, 7, 21.

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