Barcoding von genomischer DNA und Anwendung im Bereich des DNA-Mappings

  • Barcoding of genomic DNA and application in the area of DNA-mapping

Schilcher, Felix Maximilian; Weinhold, Elmar (Thesis advisor); Wöll, Dominik (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die sequenzspezifische Modifikation von DNA mittels methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG) weiterentwickelt. Ein Fokus dieser Arbeit lag auf der Synthese von Analoga des natürlichen Cofaktors von DNA-Methyltransferasen (DNA-MTasen) AdoMet. Darunter fallen sowohl AdoMet-Analoga zur Übertragung von reaktiven, als auch fluoreszierenden und sterisch anspruchsvollen Gruppen. Zur letztgenannten Gruppe gehören Analoga mit Oligodesoxynukleotidmodifikationen. Weiterhin wurde die enzymatische Aktivität der neuen AdoMet-Analoga in Aktivitätstests mit den DNA-MTasen M.TaqI und M.BseCI untersucht. Im Vergleich zu den Aktivitäten reaktiver und fluoreszierender AdoMet-Analoga, die sich nur geringfügig voneinander unterscheiden, weisen die ODN-modifizierten AdoMet-Analoga grundsätzlich geringere Aktivitäten auf, die außerdem stärker voneinander abweichen. In EMSA-Experimenten konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Übertragung der Seitenkette von AdoYnODN11, die elektrophoretische Mobilität von DNA-Fragmenten mit entsprechender Modifikation verringert. Darauf aufbauend folgten einstufige DNA-Modifikationsreaktionen mit den neu dargestellten AdoMet-Analoga. Die modifizierte DNA wurde daraufhin auf unterschiedliche Weise, sowohl optisch als auch elektronisch, untersucht. Darunter fällt die von externen Kooperationspartnern durchgeführte Analyse mit C-Trap und Nanoporen, aber auch die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von gestreckter genomischer DNA (DNA-Combing). Ein weiteres Augenmerk der vorliegenden Arbeit war die methodische Weiterentwicklung der DNA-Modifikation mittels mTAG-Methode. Dies bezieht sich zum einen auf die Einführung neuer Spezifitäten durch den Einsatz von sogenanntem DNA-Blocking, zum anderen auf die Ausweitung der Methode auf in Agarose eingebettete DNA. Letztlich wurden computergestützte Auswertungsroutinen entwickelt, mithilfe derer die fluoreszenzmikroskopische Analyse von gestreckter und immobilisierter DNA automatisiert wurde um die Güte verschiedener Modifikationsexperimente anhand von Kennzahlen vergleichen zu können.

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