Microgel-based Regenerative Materials and Biofunctionalization

Gehlen, David Benedikt; De Laporte, Laura (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

In den letzten Jahrzehnten wurden große Fortschritte im Bereich von Implantaten und medizinischen Geräten erzielt, welche in der Lage sind die Funktionen von essentiellen Organen und Geweben zu übernehmen. Zusätzlich werden stetig neue Systeme mit Biomaterialien entwickelt, um in der Grundlagenforschung das Verhalten von Zellen besser zu verstehen. Jedoch bleibt das Beherrschen der Zell-Material-Interaktion eine entscheidende Herausforderung für solche Systeme. So sind zum Beispiel häufig bei Polydimethylsiloxan (PDMS) basierten Systemen, welche oft für Studien in der Mechanobiologie verwendet werden, Beschichtungsmethoden für eine stabile Zelladhäsion notwendig, welche komplex, zeitaufwendig und instabil über längere Zeit sind, sowie toxische Komponenten beinhalten. Daher habe ich eine völlig neuartige Methode mittels Anker-Peptiden und daran fusionierten Zelladhäsion-Peptiden entwickelt, um PDMS-Oberflächen in einem Schritt auf robuste und umweltfreundliche Art zu beschichten und somit stabile Zelladhäsionen zu erzielen. Ein Hauptziel der modernen Medizin bleibt die Produktion und Regeneration von voll funktionsfähigen Geweben und Organen. Große Fortschritte wurden in den letzten Jahrzehnten bei der Entwicklung neuer intelligenter Materialien durch komplexe Herstellungsmethoden erzielt, um kontrolliert Zell-Konstrukte herzustellen. Die wissenschaftliche Disziplin dafür wird „Tissue Engineering“ genannt, bei welcher nach wie vor eine große Lücke zu Produkten in der klinischen Anwendung besteht. Dies ist eine Folge der Komplexität natürlicher Gewebe in Größenordnungen von μm für einzelne Zellen, über mm für Blutgefäße, bis hin zu cm für die Anordnung von tubulären oder ähnlichen Strukturen. Hydrogele, bestehend entweder aus natürlichen oder synthetischen hydrophilen Polymeren, sind die vielversprechendsten Ansätze um injizierbare 3D-Gerüste zur Geweberegeneration von weichen und sensitiven Geweben zu erzeugen. Jedoch haben die meisten synthetischen Hydrogele mit elastischen nanometer-großen Netzwerken keine ausreichende Porosität, welche essentiell ist für Zellinfiltration, Migration und Proliferation. Um dieses Problem zu lösen habe ich einen einfachen und schnellen Prozess entwickelt, um granulöse Hydrogel-Netzwerke zu erzeugen. Mit Calcium vernetzte Cellulose-Nanofibril Hydrogele werden durch ein Nylongewebe zerkleinert, was zu homogenem 3D-Zellwachstum führt. Für einen kontrollierteren Ansatz habe ich ein mikroporöses Gerüst aus enzymatisch vernetzten Mikrogelen entwickelt. Die Kombination von stäbchenförmigen und kugelförmigen Mikrogelen führt dabei zu einer maximalen Porosität. Zur Regeneration von funktionalen Geweben oder für ex vivo Gewebemodellen ist die Nachahmung der Struktur und der hierarchischen Anordnung entscheidend. So haben Nieren zum Beispiel tubuläre Strukturen. Um diese tubulären Strukturen in einer umgebenden Matrix nachzuahmen habe ich Cellulose-Nanofibril-Mikrogele, durch pipettieren der Lösung in ein rührendes Calciumbad und anschließender mechanischer Zerkleinerung der Fäden während der Aufreinigung, erzeugt. Fibroblasten können auf der Oberfläche der Mikrogele kultiviert und anschließend in synthetische PEG-basierte Hydrogele eingebettet werden, wodurch die Produktion von tubulären Zellstrukturen innerhalb einer kontrollierbaren umgebenden Matrix ermöglicht wird. In vivo-Therapien für empfindliche Gewebe, wie das Rückenmark, benötigen minimal-invasive Injektionen, um Implantationen und zusätzliches Entfernen von gesundem Gewebe zu vermeiden. Hierfür habe ich am Anisogel-System (Anisotropes Hydrogel) gearbeitet, welches nach der Injektion in situ eine ausgerichtete Struktur mit hoher Kontrolle über die mechanischen, biochemischen und strukturellen Eigenschaften bildet. Dies wird durch Einlagerung von superparamagnetischen Nanopartikeln in stäbchenförmigen Mikrogelen mit definierten mikrometer-großen Durchmessern erreicht, welche eine Mikrogel-Ausrichtung parallel zu einem magnetischen Feld in einer Lösung erlauben. Anschließend vernetzt die umgebende Lösung enzymatisch, um die orientierten Mikrogele zu fixieren. Hierbei habe ich zum ersten Mal zeigen können, dass nicht nur die Zellen im Anisogel ausgerichtet sind, sondern auch das von den Zellen produzierte Fibronektin, was eine potentielle Feedback-Steuerung nahelegt. Eine zusätzliche Biofunktionalisierung der Strukturelemente mit Zelladhäsions-Peptiden resultiert in zahlreichen Interaktionen mit den Zellen und einer geringfügig besseren Zell-Ausrichtung, aber verringert die Menge an durch die Zellen gebildetem Fibronektin, was möglicherweise die Regeneration und das Ersetzen des temporären künstlichen Gerüsts hindert. Eine Analyse der Lokation des mechanosensitiven Proteins YAP enthüllte, dass Zellen nicht nur durch den Kontakt mit den Strukturelementen ausgerichtet werden, sondern vielmehr die gesamte Anisotropie des Anisogels fühlen, was einen komplexeren Mechanismus hinter der Zell-Ausrichtung nahelegt. Um dies weiter zu charakterisieren habe ich eine Methode mit Magnet-Anordnungen für Rheometer-Messungen entwickelt, um die gesamte mechanische Anisotropie des Anisogels analysieren zu können. Weiterhin zeigten Variationen der Strukturen im Anisogel (Mikrogele mit verschiedenen Durchmessern), dass das Volumen der Strukturelemente, um Nervenausrichtungen zu initiieren, reduziert werden kann indem Mikrogele mit Durchmessern von 2.5 μm statt 5 μm verwendet werden. Nachdem alle drei Aspekte im Anisogel-System kontrollierbar sind, welche die mechanischen, biochemischen, und strukturellen Eigenschaften sind, habe ich daran gearbeitet aktiv bewegende Mikrogele in einer umgebenden Matrix zu generieren, welche potentiell Zellen stimulieren können. Jedoch haben sich die eingebetteten Mikrogele nicht bewegt und stärkere magnetische Eigenschafen der Mikrogele sind für die Zukunft notwendig um Kräfte in einer relevanten Größenordnung zu generieren. Um die Anwendbarkeit der magnetisch responsiven Mikrogele für andere Anwendungen zu vergrößern, wie für Bioprinting mit Magnetfeldern, habe ich zusätzlich an einer Methode zur Vorprogrammierung der Orientierungswinkel der Mikrogele in einem statischen Magnetfeld gearbeitet. Dazu wurden ellipsoide Maghemit-Nanopartikel im Mikrogel-Netzwerk mit einem definierten Winkel während der Vernetzung ausgerichtet, wodurch die Mikrogele in einem Magnetfeld entsprechend dieser Vorausrichtung ausgerichtet werden können. Zusammenfassend führte die Variierung und Nachahmung der biochemischen Eigenschaften, der Makro-Porosität, und der orientierten Struktur von natürlichen Geweben zu einem besseren Verständnis von 3D-Zellwachstum in künstlichen Gerüsten, was zukünftig weiterentwickelt wird, um Zellen während der Gewebebildung zu stimulieren.

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