Electrochemical aptamer biosensors for the detection of amyloid-beta oligomers

Zhang, Yuting; Simon, Ulrich (Thesis advisor); Offenhäusser, Andreas (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist die am weitesten verbreitete, chronische, neurodegenerative Erkrankung, die mit einem fortschreitenden und irreversiblen Verlust kognitiver Fähigkeiten verbunden ist. Deren Frühdiagnose ist von besonderer Dringlichkeit, da Alzheimer eine Latenzzeit von mehr als 20 Jahren aufweist. Amyloid-β Oligomere (AβO) sind wichtige diagnostische Biomarker für AD und ein bedeutendes therapeutischen Ziel die Krankheit zu heilen. In letzter Zeit deuten immer mehr Studien darauf hin, dass AβO toxisch für Zellen des zentralen Nervensystems ist, hervorgerufen durch Störung der Funktion von Rezeptoren der Zellmembran sowie Störungen des Ionenaustauschs durch abnormale Membranstrukturen. Daher hat sich die Suche nach Biosensoren, die selektiv und sensitiv AD Biomarker nachweisen können, zu einem bedeutenden Forschungsfeld entwickelt. In dieser Arbeit wird über die Entwicklung von elektrochemischen Aptamersensoren für den spezifischen Nachweis von AβO berichtet, basierend auf der Bindung zwischen diesen Biomarkern und ssDNS Aptamerrezeptoren. Zu Beginn wurde ein einfacher labelfreier elektrochemischer Biosensor hergestellt. Die Analyse der Daten der Elektrochemischen Impedanzspektroskopie (EIS) ergab für diesen Sensor einen breiten linearen Konzentrationsbereich von 0.1 nM bis 500 nM und eine niedrige Detektionsgrenze von 0.03 nM. Weiterhin wurde der Sensor aufgrund seiner hohen Selektivität für die Verfolgung von Aβ Aggregationsprozesse genutzt. Die Ergebnisse wurden durch Rasterkraftuntersuchungen validiert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass der Sensor für den Nachweis der Biomarker in künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit (aCSF) mit zufriedenstellender Genauigkeit benutzt werden kann. Nach gegenwärtigem Kenntnisstand ist dies der erste labelfreie Aptamersensor für den Nachweis von AβO basierend auf EIS, der mit aCSF duchgeführt werden kann und die Untersuchung des Aggregationsverhaltens von Amyloidmolekülen erlaubt. Um jedoch die unspezifische Bindung zwischen Sensoroberfläche und Analytmoleküle zu unterdrücken und die Sensitivität des AβO Nachweises zu erhöhen, wurde ein Aptasensor basierend auf Stamm-Schleifen Rezeptoren entwickelt. Hierfür wurden die Rezeptoren mit Redoxsonden modifiziert, was einen amperometrischer Nachweis mittels Wechselsstrom-Voltammetrie (ACV) ermöglichte. Der Wechsel des Transducerprinzips war auch für die Miniaturisierung des Sensors von entscheidender Bedeutung, da die hohe Impedanz von Mikroelektroden impedimetrische Nachweise erschwert. Das amperometrische Transducerprinzip beruht auf dem Ladungstransfer von aptamerassoziierten Redoxgruppen, der von Konformationsänderungen des Rezeptors abhängt. Die Stamm-Schleifen Struktur wurde bezüglich der Stammlänge, Spacersequenz und Position der Redoxgruppe am Aptamerrezeptor optimiert. Zusätzlich wurde der Einfluss der Aptamerkonzentration und der ACV Frequenz auf das Sensorsignal untersucht. Von allen getesteten Sequenzen erwies sich (B-3’ Fc) mit der Redoxsonde am 3’- und einer Thiolgruppe am 5’-terminalen Ende als am besten geeignet mit einem breiten Konzentrationsbereich, der sechs Größenordnungen umspannte. Es wurde weiterhin beobachtet, dass die Detektionsgrenze zu niedrigeren Limits verschoben werden kann, jedoch nur auf Kosten eines eingeschränkten Detektionsbereiches. Mikroelektrodenfelder (MEAs) gewinnen stetig an Bedeutung für die Entwicklung von Biosensoren aufgrund hohen Massentransports im Elektrolyten zu den Elektroden, redundanter Messsignale und hoher räumlicher Auflösung. Jedoch ist für diese Systeme die Anzahl an Rezeptoren an der Oberfläche begrenzt und die hohe Impedanz, hervorgerufen durch die geringe Elektrodengröße, erschweren das herunterskalieren der Aptamersensoren. AD ist oft mit Fehlfunktionen der Mitochondrien assoziiert, was sich stark auf die Konzentration an Adenosin Triphosphat (ATP) in Neuronen auswirkt. Die simultane Detektion von AβO und ATP mithilfe desselben MEA Chips stellt eine Chance für die Früherkennung und pathologische Untersuchungen von AD dar. Daher wurde ein Chip entwickelt, der Mikroelektroden enthält deren Oberfläche durch Goldnanostrukturen vergrößert und mit unterschiedlichen Aptamerrezeptoren modifiziert wurde. Linearvorschubvoltammetrie, Rechteckspannungsvoltametrie und Chronoamperometrie (CA) wurden verwendet, um Gold auf die Mikroelektroden zu deponieren (3D-GMEs). Die Oberflächenmorphologie der unterschiedlichen Nanogold-Mikroelektroden wurde mithilfe von Rasterelektronenmikroskopie untersucht und deren elektroaktive Oberfläche durch Oxidations-Reduktionszyklen in schwefelsauren Lösungen ermittelt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen legten nahe, das Chronoamperometrie den besten Kompromiss zwischen großer elektroaktiver Oberfläche und Sensorstabilität lieferte. CV und EIS wurden verwendet, um die 3D-GMEs elektrochemisch zu charakterisieren. Die Änderungen der Redoxsignal, hervorgerufen durch Konformationsvariationen der Ferrocen-markierten Aptamermoleküle, wurden mit ACV detektiert. Die Stamm-Schleifen-Aptamer modifizierten 3D Goldmikroelektroden waren in der Lage, AβO in einem breiten Konzentrationsbereich von 1 pM bis 200 nM nachzuweisen. Zudem wurde die Selektivität, Stabilität, Wiederverwendbarkeit und Arbeitsfähigkeit in realen Proben untersucht. Abschließend, wurden Methoden zur gezielten elektrochemischen bzw. plasmachemischen Regeneration von ausgewählter Elektroden des Elektrodenfeldes entwickelt, damit weitere Aptamerrezeptoren an diese Elektroden des Sensorfeldes gebunden werden können. Beispielhaft wurden die regenerierten 3D Gold Mikroelektroden mit ATP Aptameren modifiziert und der korrespondierende Analyt in einem Detektionsbereich zwischen 0.01 nM und 1000 nM mit einem Detektionslimit von 0.002 nM nachgewiesen. Abschließend konnten ATP und AβO gleichzeitige in derselben Analytlösung nachgewiesen werden. Die einfache Herstellung, Miniaturisierbarkeit, Sensitivität im Pico-Molarbereich und darunter, als auch Selektivität selbst gegenüber anderen Aβ Spezies macht die hier entwickelten AβO Aptamersensoren interessant für Point-of-Care Anwendungen als auf für pharmakologische Wirkstoffstudien.

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