Sequenzspezifische Synthese und Anwendung von kovalenten DNA-Protein- und DNA-Oligonukleotid-Konjugaten

  • Sequence-specific synthesis and application of covalent DNA-protein and DNA-oligonucleotide conjugates

Rauser, Miriam; Weinhold, Elmar (Thesis advisor); Markus, Albrecht (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Aufgrund der Kombination der einzigartigen strukturellen oder kodierenden Eigenschaften der DNA mit den vielseitigen Funktionalitäten von Proteinen können DNA-Protein-Konjugate in vielen Bereichen der Molekulardiagnostik und Biotechnologie eingesetzt werden. Zur Herstellung von sequenzspezifischen kovalenten DNA-Protein-Konjugaten wurde die Methode methyltransferase directed Transfer of Activated Groups (mTAG) mit der SNAP-tag Technologie verknüpft. So wurde zunächst lange DNA sequenzspezifisch mit einer O6-Benzylguanin (BG)-Seitenkette eines Cofaktor AdoInBG35 durch eine DNA-Methyltransferase (DNA-MTase) modifiziert. Mit Hilfe der SNAP-tag Technologie konnte anschließend BG-modifizierte DNA mit verschiedenen SNAP-tag Fusionsproteinen markiert werden. Das SNAP-tag Protein kann dabei mit z.B. DNA-MTasen oder Fluoreszenzproteinen genetisch fusioniert werden und reagiert spezifisch mit diversen BG-Substraten. Ein Anwendungsbereich der kovalenten DNA-Protein-Konjugate befasste sich mit der adressierten DNA-Methylierung und DNA-Markierung. Durch die kovalente Bindung der DNA Cytosin-C5 MTase SNAP-M.MpeI an eine Position auf Plasmid-DNA Litcon30, kann SNAP-M.MpeI nur Sequenzen in der Nähe der kovalenten Bindungsstelle methylieren. Bei dem Vergleich der verschiedenen DNA-Konformationen (linear, nicked und supercoiled) wurde der höchste DNA-Methylierungsgrad der entsprechenden Zielsequenz in der linearen DNA-Konformation erzielt. Unspezifische DNA-Methylierungen entstanden durch die DNA-Verdrillung der nicked und supercoiled Form. Die Verdrillung hat zur Folge, dass die kovalent gebundene SNAP-M.MpeI auch in der Sequenzabfolge weitentfernte, aber räumlich Nahe unspezifische Sequenzen erreichen kann. Aufbauend darauf wurde bei der adressierten DNA-Markierung anstelle der Methylgruppe ein Fluorophor des Cofaktors AdoInTAMRA auf die Zielsequenzen übertragen. Lineare T7-DNA wurde an drei Positionen kovalent mit DNA adenin-N6 MTase SNAP-M.TaqI markiert, wobei nur eine der kovalent gebundenen SNAP-M.TaqI in der Lage war drei Erkennungssequenzen zu erreichen. Die Verwendung von Fluorophoren und T7-DNA, welche im Vergleich zu Plasmid-DNA um ein Vielfaches länger ist, ermöglichte die Analyse mittels Fluoreszenzmikrokopie. Durch Fluoreszenzaufnahmen konnte aus statistischer Sicht die adressierte DNA-Markierung der Zielsequenzen nachgewiesen werden. Unter Verwendung des Fusionsproteins aus SNAP-tag und dem gelb fluoreszierenden Protein (YFP) konnte ebenfalls Plasmid-DNA pUC19 und T7-DNA im Zuge der kovalenten Konjugatsynthese auch durch Proteine sequenzspezifisch fluoreszenzmarkiert werden. Für die BG-Modifikation wurden DNA Cytosin-C5 MTase M.HhaI und M.TaqI eingesetzt. Die sequenzspezifische Fluoreszenzmarkierung von pUC19 mit SNAP-YFP wurde mittels Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) ermittelt. Mittels Fluoreszenzmikroskopie konnte das Sequenzmuster der mit SNAP-YFP markierten TaqI-Positionen auf T7-DNA auch ohne DNA-Interkalator aufgrund der hohen Anzahl an TaqI-Sequenzen größtenteils identifiziert werden.Die Entwicklung einer Methode zur CpG-Methylierungsdetektion ist ebenfalls von großem Interesse, da CpG-Methylierungen in Säugetieren bei der Genexpression eine große Rolle spielen, es aber für das Dinukleotid CpG keine methylierungssensitive Restriktionsendonuklease gibt. Für eine solche Methode wurden DNA-Oligonukleotid (ODN)-Konjugate synthetisiert. Die Herstellung der Konjugate erfolgte direkt durch sequenzspezifische Übertragung einer ODN-Seitenkette des Cofaktors AdoInODN durch die CpG-sensitive M.TaqI auf Plasmid-DNA pBR322. M.TaqI erkennt die Sequenz TCGA. Unter dem Einsatz der DNA-ODN-Konjugate bei der Sanger-Sequenzierung wurde die DNA-Polymerase während der Synthese des komplementären Strangs durch die ODN-Markierung an der TaqI-Sequenz blockiert. Dies lies sich im Sequenzierchromatorgramm durch einen Intensitätsabfall nach der TaqI-Sequenz identifizieren. Unter Verwendung von ODN-Seitenketten mit zwei, acht und elf Nukleotiden wurde durch die längeren Seitenketten ODN8 und ODN11 im Vergleich zu ODN2 eine etwas stärker Blockierung erzielt. Wenn nun das Cytosin innerhalb der TaqI-Sequenz methyliert ist, kann M.TaqI die ODN-Seitenkette nicht mehr auf Adenin übertragen und es entsteht kein Intensitätsabfall im Sequenzierchromatogramm. Dies bestätigt somit die CpG-Methylierung.

Identifikationsnummern

Downloads