Developing inhibitors of the enzyme ‘TRMT2a’ for the treatment of PolyQ diseases

Margreiter, Michael Alois; Bolm, Carsten (Thesis advisor); Weinhold, Elmar (Thesis advisor); Rossetti, Giulia (Thesis advisor); Niggemann, Meike (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Obwohl die jeweiligen Ursachen aller neun Polyglutaminerkrankungen schon seit Jahrzehnten bekannt sind, gibt es bisher keine zugelassenen kurativen Therapien. Gängige Ansätze stellen die Symptomlinderung in den Mittelpunkt. Das ist insofern bemerkenswert, als dass diese Erkrankungen auf einzelne Mutationen in den krankheitsrelevanten Genen zurückzuführen sind. Eine weitere herausragende Gemeinsamkeit dieser Erkrankungen ist die Bildung von unlöslichen Aggregaten der mutierten Proteine in bestimmten Zellpopulationen des Gehirns, oft bereits ab der Lebensmitte. Deshalb besteht ein offensichtlicher Bedarf an effektiven und neuroprotektiven Strategien, welche imstande sind, den Zeitpunkt des Einsetzens sowie das Fortschreiten dieser letztendlich tödlichen Erkrankungen hinauszuzögern. In diesem Sinne konnten frühere Untersuchungen an der Uniklinik Aachen (Dr. Voigt, Neurologie) zeigen, dass tRNA Methyltransferase 2 Homolog A (TRMT2a) ein effektiver Modulator, der durch die Polyglutaminerkrankungen induzierten Neurotoxizität ist. Rechnergestützte Biologie umfasst eine Vielzahl von Methoden, mit dem Ziel die oftmals heterogenen biologischen Datensätze einzuordnen. Dieses aufstrebende Forschungsfeld konnte bereits substanzielle Beiträge zu unserem Verständnis der molekularen Grundlagen von Gesundheit und Pathogenese leisten- wie auch im Falle der Polyglutaminerkrankungen. Zudem kann ein detailliertes Verständnis dieser Prozesse zur Entdeckung und Entwicklung von neuartigen Wirkstoffen verwendet werden, auch bekannt als computergestütztes Wirkstoffdesign (CADD). In dieser Dissertation kommen derartige state-of-the-art Ansätze zur Anwendung, um Einblicke in das Protein TRMT2a auf Sequenz- und Strukturniveau zu erhalten. Dazu verglich ich die Sequenz von TRMT2a mit eng verwandten Sequenzen und identifizierte zunächst evolutionär konservierte Residuen. Da zu Beginn dieser Arbeit keine strukturellen Informationen zum Protein vorlagen, erstellte ich Homologiemodelle. Diese Untersuchungen erlaubten schlussendlich die Auswahl eines geeigneten Proteinfragmentes. Dieses Fragment konnte exprimiert/aufgereinigt werden und führte darüber hinaus zur ersten Kristallstruktur einer Domäne von TRMT2a (Prof. Niessing, Universität Ulm). Des Weiteren wollte ich herausfinden, ob eine pharmakologische Inhibition von TRMT2a ähnlich neuroprotektive Effekte wie der entsprechende knock-down zeigen würde. Daher untersuchte ich die Apostruktur der besagten Domäne nach Bindetaschen, welche die Bindung etwaiger niedermolekularer Stoffe ermöglichen würden. Leider konnte ich keine geeignete Tasche in der Kristallstruktur detektieren. Letztendlich repräsentiert eine Kristallstruktur jedoch nur einen sehr begrenzten Konformationsraum, wohingegen Proteine in Lösung oftmals viele verschiedene Konformationen einzunehmen imstande sind. Nachdem ich zunächst das kristallographische Wassernetzwerk analysiert hatte, erweiterte ich deshalb meine Suche nach einer geeigneten Bindetasche indem ich auch dynamische Aspekte der Domäne in meine Modelle miteinbezog. (i) Anfänglich verwendete ich Methoden, die auf maschinellem Lernen beruhen, um Residuen vorherzusagen, welche zu lokaler Flexibilität im Protein führen (ii) allosterische Kommunikationsnetzwerke der Residuen untereinander beschreiben um darauf aufbauend (iii) molekulardynamische Simulationen in implizitem Solvent mit störungstheoretischen Ansätzen durchzuführen. In diesen Analysen zeichnete sich eine transiente Bindetasche ab, welche zudem adäquat schien, auch niedermolekulare Stoffe zu binden. Um ein detaillierteres Verständnis der Bildung und des Kollapses dieser Tasche zu erhalten führte ich extensive (iv) molekulardynamische Simulation in explizitem Solvent, d.h. mit einem atomistischen Wassermodell, durch. Darauf basierend selektierte ich eine geeignete Konformation der Domäne und führte ein virtuelles Screening mit kommerziell verfügbaren Chemikalien durch. Ich wählte mehrere (zur Bindetasche komplementäre) Chemikalien aus und Dr. Voigt's Labor testete diese \textit{in vitro} zuerst in HEK Zelllinien. Es zeigte sich, dass zahlreiche dieser Chemikalien ähnlich effizient wie der knock-down von TRMT2a im Stande waren, polyglutamin-induzierte Toxizität zu reduzieren, während keine weitere Besserung bei Zellen festgestellt werden konnte, bei denen TRMT2a praktisch nicht vorhanden war. Es könnte deshalb sein, dass mehrere dieser Chemikalien tatsächlich TRMT2a inhibieren. Darüber hinaus konnte Prof. Niessing's Labor für ein wirksames Molekül eine dosisabhängige Bindung an die Domäne in Surface Plasmon Resonance (SPR) Versuchen nachweisen. Interessanterweise konnten einige dieser Chemikalien die Anzahl toxischer Aggregate auch in Fibroblasten, welche von polyglutamin-erkrankten Patienten gespendet wurden, drastisch reduzieren. Dieser Effekt konnte zudem bei Fibroblasten mit anderen PolyQ-Erkrankungen nachgewiesen werden. Für diese chemischen Strukturen läuft derzeit in Kooperation mit den Forschergruppen von Prof. Shah und Prof. Schulz (beide Forschungszentrum Jülich), Dr. Voigt und Prof. Niessing, eine weltweite Patentanmeldung. Im zweiten Teil meiner Arbeit untersuchte ich die möglichen Konsequenzen einer gestörten TRMT2a Funktion. Meiner Arbeitshypothese nach, sollte eine verringerte TRMT2a Konzentration/Aktivität zu einer fehleranfälligeren Translation von Polyglutamin-Abschnitten führen. Unterbrochene Polyglutamin-Abschnitte erwiesen sich in früheren Studien als weniger toxisch, zudem werden in diesen Fällen weniger Aggregate beobachtet. Deshalb simulierte ich Konstrukte mit kontinuierlichen und unterbrochenen Polyglutamin-Abschnitten mithilfe von Replica Exchange Protein Monte Carlo Methoden und verglich die jeweiligen physikochemischen Eigenschaften, welche zu den experimentell beobachteten unterschiedlichen Aggregationsverhalten führen. Im dritten Teil meiner Dissertation, verwendete ich CADD um einen Einblick in Proteine zu gewinnen, die bei der Schmerzentstehung eine Rolle spielen. Dazu untersuchte ich in Kollaboration mit Prof. Gründers Team (Universitätsklinikum Aachen), wie das Peptid RPRFa (ein RFamid aus dem Gift der Kegelschnecke) den säureempfindlichen Ionenkanal 3 (ASIC3) bindet. Dieser protonengesteuerte Na Kanal ist bei Neuralgien von Bedeutung. Hier erstellte ich ein Homologiemodell und untersuchte in welcher Konformation diese Peptidgruppe den Kanal an welcher Stelle binden könnte. Auf Basis dieser Bindehypothesen, wählten ich mehrere Punktmutationen aus. Prof. Gründers Labor beurteilte ihre Auswirkungen mit elektrophysiologischen und UV-vernetzenden Methoden. In einem Folgeprojekt mit derselben Gruppe erstellte ich ein Modell eines Komplexes bestehend aus Dynorphin A (1-14) und ASIC1 basierend auf einem ähnlichen Ansatz. Zudem erweiterte ich diese Untersuchung mit molekulardynamischen Simulationen in explizitem Solvent. Zusammenfassend sind die Ergebnisse meiner Arbeit ein Hinweis darauf, dass rechnergestütze Ansätze in den Lebenswissenschaften nicht nur eine Interpretation der experimentellen Ergebnisse ermöglichen, sondern derartige Untersuchungen zudem leiten und komplementieren können, wenn solche Ansätze bereits im kritischen Anfangsstadium eines Projektes miteinbezogen werden.

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